竇蒙家, 李曉瑩，饒偉 *
低溫生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)北京市重點實驗室，中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所低溫生物醫(yī)學(xué)是研究低溫與生物體相互作用規(guī)律及其醫(yī)學(xué)應(yīng)用的學(xué)科。目前，低溫生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用主要涉及低溫保存及低溫治療兩方面（圖 1）。其中，低溫保存是指將生物材料（如細(xì)胞、組織、器官）在添加低溫保護(hù)劑的情況下冷卻至低溫（一般為 -196 ℃ 液氮）進(jìn)行保存，待需要時再將其以有效的方式復(fù)溫至正常溫度（37 ℃），此時生物樣品仍可恢復(fù)并保持其活性。低溫治療則是以微創(chuàng)介入的方式將探針插入腫瘤組織，手術(shù)開始后探針內(nèi)部冷介質(zhì)在探針頭部與腫瘤組織進(jìn)行冷量交換，使腫瘤組織處于低溫環(huán)境，冰球完全覆蓋腫瘤組織（≤-20 ℃）并維持一段低溫治療時間，以達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的，手術(shù)結(jié)束后取出探針，腫瘤原位消解。
圖 1 低溫保存及低溫治療示意圖 [1][2]
1、凝固時光的技術(shù)——低溫保存
在低溫下，生物體新陳代謝的速率大大降低（圖 2），進(jìn)入「生理機(jī)制暫?！沟臓顟B(tài)，同時有效躲避了外界干擾，為「無限期」保存創(chuàng)造了條件，因此低溫保存能使生物材料得以長期安全保存。一般來說，樣品保存的溫度越低，保存的時間就越長，在 4 ℃ 時存活時間只有數(shù)小時的生物樣本，在 -80 ℃ 下可以保存數(shù)月，在 -196 ℃ 下，隨著反應(yīng)速率近乎于 0，能保存數(shù)個世紀(jì)。目前，低溫保存技術(shù)是生物材料長期保存的唯一可行途徑。
圖 2 生物樣品低溫保存的時間與溫度之間的關(guān)系
植物細(xì)胞—保存時間極其長：植物種子由于含水量非常低，冷凍過程冰晶破壞作用很小，因此可以長期保存。在植物種子的長期保存上，低溫保存提供了必不可少的技術(shù)支撐，具有省事、省工、省費(fèi)用的特點，尤其適合長期保存珍貴稀有種子。一位俄羅斯科學(xué)家利用三萬年前冰凍在西伯利亞科雷馬河永凍層里的種子，成功培育出一棵植物，打破復(fù)蘇最古老植物種子的記錄（圖 3），事實上正是低溫環(huán)境使得該物種的遺傳物質(zhì)得以完整的保存，幫助這枚種子安全度過三萬年的休眠期。在挪威斯瓦爾巴特群島上，有一個全球最大的植物末日種子庫（圖 4），以防因全球物種迅速縮減而造成物種滅絕，被稱為「世界末日」地球資源的諾亞方舟。
圖 3 俄羅斯科學(xué)家復(fù)蘇三萬年前的種子 [3]
圖 4 挪威植物末日種子庫 [4]
動物細(xì)胞—部分生殖細(xì)胞已經(jīng)實現(xiàn)較長時間保存：在新興的醫(yī)學(xué)前沿領(lǐng)域，利用現(xiàn)代低溫保存技術(shù)，人類精子、卵子及胚胎長期保存已成為現(xiàn)實（圖 5）。1983 年，世界首例「冷凍寶寶」出生，人類胚胎低溫保存技術(shù)逐漸發(fā)展成熟，低溫保存技術(shù)逐漸成為輔助生殖技術(shù)中不可或缺的重要技術(shù)之一。2017 年年末，美國冷凍了 24 年的胚胎寶寶出生，打破了保存最久冷凍胚胎成功生產(chǎn)的世界紀(jì)錄?，F(xiàn)代胚胎保存是將胚胎和低溫保護(hù)劑裝入專用的冷凍管中，通過快速冷凍（玻璃化保存）的方法使胚胎浸入 -196℃ 的液氮中，減少代謝從而得以保存。目前，穩(wěn)定的高復(fù)活率胚胎冷凍技術(shù)仍然是研究人員追求的目標(biāo)，這將為不孕不育患者保存生育能力、延續(xù)生命提供基礎(chǔ)技術(shù)支持。除此之外，各類生物樣本庫（如生殖樣本庫、疾病樣本庫、中華民族生物樣本庫及干細(xì)胞庫等）的建設(shè)，為保存各種人類資源都起到了重大作用。
圖 5 低溫保存輔助生殖技術(shù) [5]
組織器官—目前少數(shù)器官實現(xiàn)了短期保存：對于器官移植，臨床上目前多采用短期低溫保存或延時保存技術(shù)（4℃ 左右），但器官的冷缺血耐受時間（不損害器官結(jié)構(gòu)功能的前提下，從放置在低溫環(huán)境到正?；謴?fù)血供的時間）較短，心肺為 4 小時，肝、腸、胰腺為 8～12 小時，腎最長為 36 小時，但其功能細(xì)胞 - 腎小球耐受時間只有不到 24 小時。這導(dǎo)致了目前臨床上超過 70% 的心臟移植手術(shù)因為評估和匹配所需時間超過了保存限制而被放棄。我國每年需要進(jìn)行腎器官移植的人約有 30 萬，但實際只有 2000 多人能及時獲得適配器官接受手術(shù)。因此面對器官庫短缺以及可用率低的問題，最有效的解決方案就是尋求器官長期有效的低溫保存方法，目前這一方向仍是全球挑戰(zhàn)性的重大難題。活性物質(zhì)—低溫保存賦能其廣泛應(yīng)用：在抗擊新冠病毒的醫(yī)療領(lǐng)域，低溫保存技術(shù)也發(fā)揮了重要的作用。由于不同疫苗有著不同的儲運(yùn)條件，這給冷鏈儲存帶來巨大挑戰(zhàn)，其中抗擊新冠疫情的 mRNA 疫苗，對低溫儲運(yùn)的要求極為嚴(yán)格（圖 6），需要動態(tài)的深低溫儲運(yùn)環(huán)境。針對不同的疫苗儲運(yùn)，目前已制定了標(biāo)準(zhǔn)的保存流程，為新冠疫苗的冷鏈輸運(yùn)提供堅實的技術(shù)支持。
圖 6 新冠病毒疫苗低溫保存參數(shù) [6～10]
低溫保存技術(shù)歷經(jīng)數(shù)十年的發(fā)展，在實驗方法上取得了巨大成功，特別是近幾十年來，利用低溫保存技術(shù)，已成功地實現(xiàn)了對絕大多數(shù)種類細(xì)胞的保存，在皮膚、角膜等簡單組織的低溫保存上也取得了一定進(jìn)展，并在組織再生及器官移植中得到廣泛應(yīng)用，極大地推動了臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展。器官甚至是活體的保存挑戰(zhàn)仍在推動著這一領(lǐng)域的向前發(fā)展。
2、殺滅腫瘤的利器——低溫治療
早在古埃及時代，人們就通過冷敷來減輕炎癥，低溫的治療作用已被發(fā)現(xiàn)。近世紀(jì)以來，戰(zhàn)場上，醫(yī)護(hù)人員利用低溫減輕肢體手術(shù)的疼痛。而近年來，低溫對于治療腫瘤、減緩癌癥發(fā)展的作用也逐漸被人們認(rèn)識。
低溫治療腫瘤（圖 7），通常是以一種微創(chuàng)的方式將冷凍探針直接插入到腫瘤部位，并利用制冷技術(shù)在探針針頭實現(xiàn)可控的降溫和升溫功能。在冷凍過程中，探針周圍會形成冰球，使腫瘤組織溫度低至 -20 ℃ 以下，通過探針持續(xù)不斷地冷凍、解凍病灶，產(chǎn)生一系列不可逆損傷，達(dá)到消除病灶的目的。與其他治療方式相比，低溫手術(shù)由于具有影像可視、麻醉鎮(zhèn)痛、止血或減少出血、手術(shù)創(chuàng)口小以及能防止腫瘤擴(kuò)散等優(yōu)點，并且其副作用遠(yuǎn)低于放療和化療，因而在腫瘤治療方面贏得了「綠色療法」之譽(yù)。低溫外科手術(shù)已拓展應(yīng)用到幾乎所有的實體腫瘤治療，被學(xué)術(shù)界和醫(yī)學(xué)界公認(rèn)為是一種治療腫瘤的重要方法。
低溫治療癌癥效果顯著，復(fù)發(fā)率低。早在 1961 年，美國醫(yī)生 I. S. Cooper 就首次運(yùn)用液氮冷刀，取得了良好的醫(yī)療效果。2002 年，日本慶應(yīng)大學(xué)醫(yī)學(xué)院利用低溫治療 42 例晚期肝癌患者，腫瘤的完全消融率達(dá)到了 92.2%。2004 年，密歇根大學(xué)綜合癌癥中心報道了冷凍消融直徑 ≤ 1 cm 的浸潤性乳腺導(dǎo)管癌，冷凍消融成功率為 100%（27/27）。2017 年，美國研究人員在學(xué)術(shù)期刊 JVIR 上發(fā)表了一組關(guān)于低溫治療腎癌的臨床數(shù)據(jù)，共 302 名腎癌患者接受了低溫治療手術(shù)，32 個月后，腫瘤的復(fù)發(fā)率僅為 3.2%。
低溫治療癌癥蓬勃發(fā)展，對于癌癥患者來說，不僅僅是治療上有了新的更加低痛苦的選擇，更是帶來了生的希望。臨床上，對各種類型的早中晚期惡性實體瘤（比如肝癌、肺癌、乳腺癌等）患者，均可采取低溫治療方式。特別是對于那些失去了常規(guī)手術(shù)治療機(jī)會的晚期患者、轉(zhuǎn)移患者、年齡大或身體虛弱患者、不愿意進(jìn)行常規(guī)手術(shù)的患者，低溫治療癌癥為他們提供了生的希望。
隨著低溫外科手術(shù)（也被稱為冷凍治療）在惡性腫瘤治療中令人鼓舞的大量成功應(yīng)用，腫瘤微創(chuàng)冷凍治療逐漸成為低溫生物醫(yī)學(xué)技術(shù)在現(xiàn)代臨床實踐中發(fā)揮重大關(guān)鍵性作用的一個典范（圖 8）。以中國為例，經(jīng)過短短十余年的快速發(fā)展，目前全國已有數(shù)百家醫(yī)院 (如北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院、復(fù)旦腫瘤醫(yī)院、北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院、中國人民解放軍總醫(yī)院等) 開展腫瘤冷凍治療業(yè)務(wù)，并呈快速增長趨勢；而在美國，開展冷凍治療的醫(yī)院已超過 450 家 ( 如 MD Anderson Cancer Center, Mayo Clinic, Mountain Sinai Hospital 等）。最近幾年，全球多個區(qū)域還紛紛成立冷凍治療學(xué)會，旨在推進(jìn)這一新型高效腫瘤療法的研究和應(yīng)用。不難看出，國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界對腫瘤冷凍治療技術(shù)具有廣泛而迫切的重大需求。
圖 8 復(fù)合式低溫冷凍腫瘤微創(chuàng)治療系統(tǒng)康博刀用于臨床治療腫瘤 [16]
3、低溫雙刃劍：默默無聞的保護(hù) or 所向披靡的破壞？
低溫保存與低溫治療都是通過低溫來實現(xiàn)，那么兩者之間有什么差異呢？究竟兩者如何區(qū)分呢，又如何確保各自的效果呢？
低溫保存與低溫治療具有類似的操作流程：實施降溫使生物樣本處于低溫環(huán)境，再通過復(fù)溫使生物樣本處于常溫環(huán)境中。是否添加低溫保護(hù)劑：在低溫保存過程中，需要借助材料和技術(shù)的手段，減少相變過程中冰核的形成、抑制冰晶的生長和重結(jié)晶的出現(xiàn)（圖 9）。對于絕大部分哺乳動物有核細(xì)胞的低溫保存來說，在同樣的降復(fù)溫條件下，是否添加低溫保護(hù)劑決定了大多數(shù)生物樣品在低溫下產(chǎn)生的是保護(hù)作用還是破壞作用。無論低溫保存降溫速度快慢如何都需要添加一定濃度的低溫保護(hù)劑來避免低溫?fù)p傷，而低溫治療則不會添加保護(hù)劑且需要強(qiáng)化冰晶的作用。
圖 9 低溫保存與低溫治療差異性
由于生物樣本中大部分成分為水（超過 70%），所以控制冰晶的形成及生長對于低溫保存功至關(guān)重要，通過選擇合適的低溫保護(hù)劑可以實現(xiàn)冰晶的生長調(diào)控，那么，一般情況下應(yīng)該如何選擇呢？通過添加抑冰材料（低溫保護(hù)劑）來調(diào)節(jié)冰晶成核和控制冰生長和形狀是十分可行的途徑（圖 10）。1949 年，英國生物學(xué)家 C. Polge 和 A. U. Smith 偶然發(fā)現(xiàn)甘油可以幫助精子經(jīng)歷低溫冷凍而不死亡，使低溫保護(hù)劑作為低溫保存的一個重要研究方向登上歷史舞臺。低溫保護(hù)劑可以幫助保護(hù)生物樣本免受低溫?fù)p傷，在細(xì)胞凍存中常被配制成一定濃度的溶液，其可以通過減少冰形成量來減少細(xì)胞脫水。低溫保護(hù)劑在降低冰晶形成速率方面表現(xiàn)突出。低溫保護(hù)劑如多元醇和糖，特別是海藻糖和蔗糖，甚至可以替代與其結(jié)構(gòu)相關(guān)的水，并防止變性或相變，以保護(hù)膜和蛋白質(zhì)免于冷凍期間的干燥應(yīng)激。在低溫保存方案的設(shè)計中，選擇合適的低溫保護(hù)劑組合，優(yōu)化低溫保護(hù)劑的濃度對于生物樣本低溫保存效果的影響非常大。
圖 10 低溫保存劑對于抑制冰晶形成、生長、及修飾冰晶形貌的作用
降溫 / 升溫參數(shù)不同：不同的降溫及升溫速率導(dǎo)致的細(xì)胞破壞力不同（見圖 11）。在添加低溫保護(hù)劑進(jìn)行保護(hù)的基礎(chǔ)上，針對不同細(xì)胞優(yōu)化低溫保存的降溫和復(fù)溫參數(shù)可以提高細(xì)胞存活率。合適的降溫速率有助于維持冰晶損傷與溶液損傷之間的平衡（如圖 11 所示），對于一般的哺乳類細(xì)胞，降溫速率經(jīng)常采用 1 ℃/min；而在升溫過程中，需要比較快的升溫速率，同時需控制復(fù)溫溫度在細(xì)胞熱損傷溫度之下，樣品從 -196 ℃ 液氮中取出放到 37 ℃ 水浴中快速復(fù)溫，這個過程一般控制在 1～2 min。在低溫治療過程中，探針附近的組織降溫速率較快，一般是 47～116 ℃/min；升溫速率也非常快，從 -196 ℃ 到 80 ℃ 的加熱循環(huán)一般控制在 2 min 之內(nèi)，迅速在深低溫及高溫之間切換時組織產(chǎn)生的熱應(yīng)力所造成的機(jī)械損傷對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了致命的破壞。值得指出的是，當(dāng)降溫速率足夠快時（比如，純水的臨界降溫速率為 3×108 ℃/min），可以實現(xiàn)低溫玻璃化保存（如圖 11a），但目前的低溫治療設(shè)備遠(yuǎn)低于這個速度，只能起到低溫破壞作用。
除了升降溫速率不同，低溫保存和低溫治療的凍融循環(huán)次數(shù)也不同。低溫保存是為了讓生物樣本在低溫下維持低代謝甚至是零代謝狀態(tài)，為了降低冰晶對生物樣本的損傷在低溫保存中往往只有一次凍融循環(huán)。而低溫治療，根據(jù)需要可以對腫瘤組織進(jìn)行多次凍融，以加強(qiáng)對腫瘤組織的破壞性。Whittaker 對倉鼠口腔粘膜進(jìn)行了反復(fù)凍融，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)冰晶會在每次凍融循環(huán)的間隔中增加。所以，為了破壞腫瘤組織，需要快速冷凍組織，并進(jìn)行反復(fù)凍融。
圖 11 不同降溫及升溫速率下的細(xì)胞損傷曲線
低溫作用對象尺度不同：低溫保存目前可以實現(xiàn)血細(xì)胞、懸浮細(xì)胞液、卵母細(xì)胞等細(xì)胞尺度樣品的成功凍存，對于 1 mm 以下的單一功能生物樣本如皮膚、角膜等也可以實現(xiàn)較高的存活率，但是，目前最為先進(jìn)的低溫保存技術(shù)對于 1 mm 以上的復(fù)雜生物樣本（包括血管與多種異質(zhì)細(xì)胞）仍存在嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，而對于低溫治療的腫瘤組織，直徑一般都在 5 mm 以上，遠(yuǎn)大于低溫保存對象尺度。因為隨著生物樣本體積增大，傳熱速度不均勻性增大，以及冰晶形成釋放大量潛熱，大尺度生物樣本的均溫一直是個難題。溫度的不均勻性及組織各向異性等引起熱膨脹不均勻，會造成嚴(yán)重的熱應(yīng)力。當(dāng)熱機(jī)械應(yīng)力超過生物組織極限時，就會造成生物樣本的永久性損傷。
4、未來：低溫保存——無冰共生，低溫治療——遇冰皆消
在低溫保存領(lǐng)域，目前對于一些簡單的細(xì)胞，已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)比較理想的凍存復(fù)活率，但是對于復(fù)雜的多細(xì)胞生物體系，如大尺度組織、器官，甚至是復(fù)雜的生命活體的低溫保存仍有待于破解，低溫對于大尺度生物樣本生命周期的拓展深深吸引著研究人員的注意。在低溫治療領(lǐng)域，因諸多活體因素制約，如何確保復(fù)雜生理環(huán)境下腫瘤的適形化消融，在精準(zhǔn)殺滅腫瘤組織的同時最大化保護(hù)健康組織和重要器官，以達(dá)到最優(yōu)化治療效果，仍然是低溫治療技術(shù)研究的主要方向。
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引用
[1] https://www.sohu.com/a/78964231_257870
[2] https://www.163.com/dy/article/DUQF20150514QIFJ.html
[3] http://news.sina.com.cn/c/2012-02-22/184923974981.shtml
[4] https://www.sohu.com/a/216071699_100068111
[5] https://www.sohu.com/a/342740870_120280712
[6] http://baijiahao.baidu.com/s?id = 1685015835025447868&wfr = spider&for = pc
[7] https://www.sohu.com/a/483439375_121124452
[8] https://www.chinaabk.com/news/show-73470.html
[9] https://www.sohu.com/a/442038690_114778
[10] https://www.163.com/dy/article/G9DJ8IAA0515CG74.html
[11] https://bbs.iiyi.com/thread-1863549-1.html
[12]http://www.hxkfh.com/zuixindongtai/20170515100306-1918.html
[13] https://www.drmed.cn/Kidney-cancer/treatment
[14] http://m.fuda120.com/patientinfo/mnxtzl/325.html
[15] http://www.hxkfh.com/zuixindongtai/20160118171324-1421.html
[16]http://tv.cctv.com/2021/05/10/VIDEawZy62vbda3yZ3 h3BSBi210510.shtml
